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Tampón de borato de sodio

Ivan Muñoz — Sun, 28 Sep 2025 18:19:12 +0000

MÉTODOS

TAMPÓN DE BORATO DE SODIO (SB)

En la electroforesis de ADN, la elección del tampón (buffer) o medio conductor es crítica y tiene consecuencias en el rendimiento, la resolución de los fragmentos y el costo económico y de tiempo. El tampón de borato de sodio (SB) posibilita una corrida electroforética más rápida a voltaje más alto y con menor producción de calor que los sistemas basados en Tris. Un medio conductor basado en sodio con borato como contraión provee mejor resolución que Tris borato EDTA (TBE) y Tris acetato EDTA (TAE).

La electroforesis de ADN y ARN ha cambiado poco a partir de la de proteínas, la misma, está restringida por TAE y TBE que generan costos superiores, producción de calor en exceso y limitaciones de voltaje y velocidad en las corridas. Tris fue establecido como el catión de uso en electroforesis, incluye EDTA que persiste en protocolos para ADN de forma innecesaria. El EDTA debería prevenir la desnaturalización, pero su contenido de sodio es parcialmente responsable de aquella. Los investigadores se refieren a los medios conductores como tampones, Tris y borato son tampones electroforéticos, pero el acetato no lo es. El término tampón en electroforesis de ADN no es un asunto de tamponamiento, sino un tema de distribución del campo eléctrico durante un periodo de tiempo. Se confunde el concepto de medio conductor con el de tampón (Brody y Kern, 2004a).

Imagen: Laboratory Equipment in Science Research Lab de Olivier Le Queinec

A voltaje constante TAE y TBE producen un bucle de retroalimentación positiva elevando la temperatura y la conductividad del medio conductor durante la electroforesis, los iones de sodio y la alta cantidad de iones Tris generan un exceso de corriente e imposibilitan correr geles a voltajes altos. El calor causa difusión de la muestra, convección, desnaturalización, y afecta la integridad del gel. Debido al agotamiento iónico rápido, los medios con cloruro de sodio producen una barrera salina asociada a una zona de deformidad en la movilidad en el gel. El cloruro de baja molaridad es adecuado para la resolución del ADN, pero no mitiga el bucle de retroalimentación.

Al incluir un anión no cloruro, otros aniones previenen la barrera salina sin requerir de un reservorio más grande o de recirculación del medio. Un anión excepcional es el borato de sodio, funciona muy bien en casi todas las condiciones electroforéticas para tamaños de fragmentos de ADN de 20 a 3.000 pb según el fabricante (Faster Better Media LCC). Puede ser corrido a tres o cinco veces la velocidad de TAE o TBE debido a su bajo calentamiento (Brody y Kern, 2004a). Al disminuir la corriente en el tiempo se evidencia que un electrolito migró tanto que no puede transportar corriente desde un electrodo al otro, SB presenta un agotamiento de electrolitos a voltaje constante a las 3 horas frente a TAE y TBE que presentan agotamiento de electrolitos en 1 hora de corrida. El ácido bórico del medio puede ser usado para corridas más largas sin recirculación.

SB puede mitigar el bucle de retroalimentación positiva. También permite mejor control de temperatura, portabilidad y conveniencia al reducir los requisitos de tensión y amperaje, mejor tasa de agotamiento de electrolitos y menor necesidad de disipar el calor (Brody y Kern, 2004b).

Tampón SB 20x - pH8

H₂O bidestilada: 800 ml

Hidróxido de sodio (NaOH): 8 g

Ácido Bórico (H₃BO₃): 45 g

1. Preparar 800 ml de H₂O bidestilada en un contenedor.

2. Agregar 8 g de NaOH.

3. Agregar 45 g de H₃BO₃ y mezclar hasta disolver totalmente los sólidos.

4. Ajustar el pH hasta 8 – 8,3 con ácido bórico o hidróxido de sodio.

5. Llevar la solución a 1 litro agregando H₂O bidestilada.

Referencias

Brody, J. R., & Kern, S. E. (2004a). History and principles of conductive media for standard DNA electrophoresis. Analytical Biochemistry, 333(1), 1–13. https://doi.org/10.1016/j.ab.2004.05.054
Brody, J. R., & Kern, S. E. (2004b). Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques, 36(2), 214–216. https://doi.org/10.2144/04362bm02
FBM Products Fast Agarose DNA Gels Lithium Sodium Borate Electrophoresis. (2025). Fasterbettermedia.com. http://fasterbettermedia.com/products.html

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Protocolo Extracción de ADN (miniprep)

Ivan Muñoz — Mon, 20 Sep 2021 00:33:15 +0000

MÉTODOS

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE ADN (MINIPREP)

Extracción de ADN

En un tubo Eppendorf de 2 ml. Machacar hojas en nitrógeno líquido. Luego agregar 800 µl de buffer de extracción.
Incubar a 65 °C durante 30 min, invertir regularmente los tubos durante este período.
Agregar 400 µl de cloroformo e invertir los tubos regularmente. Dejar 10-15 min a temperatura ambiente.
Centrifugar a 12.000 rpm durante 10 min.
Tomar 600 µl del sobrenadante (fase acuosa) y colocarlo en tubo Eppendorf de 1,5 ml para precipitar el ADN con 0,8 volúmenes de isopropanol (480 µl). El isopropanol tiene que estar a temperatura ambiente. Después de agregarlo, invertir el tubo unas diez veces suavemente para que se mezcle y centrifugar 2 min a 10.000 rpm (con el isopropanol precipitan otras cosas además del ADN por eso se utiliza a temperatura ambiente y poco tiempo).
Eliminar el sobrenadante y limpiar el pellet con 600 µl de etanol al 70%. Centrifugar 2 min a 10.000 rpm. Eliminar el sobrenadante.
Secar el pellet a temperatura ambiente durante una hora. Resuspender el ADN en 50-100 µl de TE conteniendo 20 µg/ml de ARNasa (stock ARNasa 10 mg/ml).

Figura: Se muestra esquemáticamente los pasos de la extracción de ADN de hojas de trigo

Buffer de extracción

100 mM Tris HCl pH 8

1,4 M NaCl

20 mM EDTA pH 8

2% (w/v) CTAB (agregar primero el agua, calentarla y luego agregar el CTAB para mejorar la disolución)

β-mercaptoetanol 0,5 ml/100 ml de buffer (agregarlo antes de utilizar)

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KASP

Ivan Muñoz — Thu, 16 Sep 2021 00:04:02 +0000

MÉTODOS

KASP

La tecnología KASP (Kompetitive Alelle Specific PCR) fue desarrollada en principio por KBioScience ahora LGC Genomics (Majeed, 2018; Semagn, 2013). KASP es una plataforma de genotipado uniplex que emplea una forma de PCR de competencia alelo-específica y un sistema de detección basado en fluorescencia para evaluar la variación genética bialélica de SNP (polimorfismos de nucleótido único) o de In/Del (inserciones y/o deleciones) en loci específicos (He, 2014; Semagn, 2013; Robinson, 2011).

La tecnología se basa en la extensión de oligos alelo-específicos y FRET (transmisión de energía de resonancia por fluorescencia) (Semagn, 2013), el ensayo KASP requiere de dos cebadores directos alelo-específicos (un cebador para cada SNP de cada alelo), otro cebador reverso común para ambos alelos y dos oligos, uno marcado con el fluoroforo FAM y otro con HEX, cada oligo es complementario a la secuencia terminal de cada uno de los cebadores de los alelos a evaluar, al iniciar la reacción los oligos fluorescentes están hibridados con desactivadores de fluorescencia. (He, 2014; Robinson, 2011; Majeed, 2018).

En el transcurso de la PCR, el cebador del alelo de interés se une a la hebra molde de ADN y se elonga fijando también la secuencia del extremo terminal donde se hibridará el fluoroforo correspondiente a ese alelo, tras varios ciclos de PCR el fluoroforo pierde su desactivador, se une al cebador directo y emite una señal fluorescente medible. KASP logra discriminar bialelos mediante la unión competitiva de los cebadores directos alelo-específicos, si el genotipo es homocigoto solamente se emitirá una señal fluorescente, si el genotipo es heterocigoto la señal será mixta. (Robinson, 2011).

Animación explicativa de la técnica tomada de la página oficial de LGC Biosearch Technologies

Video generado mediante IA NotebookLM de Google en base a la bibliografía propuesta en esta sección.

KASP es una de las plataformas de genotipado uniplex más usadas en especies de cultivo debido a su bajo costo y alto rendimiento (Thomson, 2014; Majeed, 2018; Rasheed, 2016; Semagn, 2013) su uso puede mejorar la velocidad y eficiencia de selección en los programas de mejoramiento (Rasheed, 2016). La aplicación de KASP es relevante en ensayos con una densidad de marcadores de baja a media, en análisis de control de calidad, mapeo de QTL en poblaciones biparentales, selección asistida por marcadores y minería de alelos (Semagn, 2013). Los marcadores moleculares convencionales pueden ser convertidos en marcadores KASP, más robustos y de más alto rendimiento (Majeed, 2018). Los ensayos KASP han sido validados para genes de adaptación, rendimiento, calidad y resistencia al estrés biótico y abiótico (Rasheed, 2016).

Protocolo de uso

[Assay Mix]

Allele-1 primer (100 uM): 12 ul

Allele-2 primer (100 uM): 12 ul

Common primer (100 uM): 30 ul

H₂O / TrisHCl (10mM, pH8.3): 46 ul

(total volume 100 ul)

[KASP reaction]

DNA (20 – 40 ng/ul): 2 ul

Assay Mix: 0.14 ul

2x Master Mix: 5 ul

H₂O: 3 ul

(total volume 10.14 ul)

[PCR condition]

94°C for 15 minutes (Hot-start activation)

10 cycles of

94°C for 20 seconds

61-55°C for 60 seconds (dropping 0.6°C per cycle)

36 cycles of

94°C for 20 seconds

55°C for 60 seconds

Plate reading at 25°C

Figura de Trigueros, donde se muestran los resultados de un ensayo KASP.

Referencias

He, C., Holme, J., & Anthony, J. (2014). SNP genotyping: the KASP assay. En Crop breeding: methods and protocols. D. Fleury and R. Whitford (Eds) pp. 75–86.
LGC Biosearch Technologies (15 de septiembre de 2021). How does KASP work. https://www.biosearchtech.com/support/education/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp-work
Majeed, U., Darwish, E., Rehman, S. U., & Zhang, X. (2018). Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): A Singleplex Genotyping Platform and Its Application. Journal of Agricultural Science, 11(1), 11. https://doi.org/10.5539/jas.v11n1p11
Rasheed, A., Wen, W., Gao, F., Zhai, S., Jin, H., Liu, J., Guo, Q., Zhang, Y., Dreisigacker, S., Xia, X., & He, Z. (2016). Development and validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat. Theoretical and Applied Genetics, 129(10), 1843–1860. https://doi.org/10.1007/s00122-016-2743-x
‌Robinson, P., & Holme, J. (2011). KASP version 4.0 SNP genotyping manual. KBioscience https://www.cerealsdb.uk.net /cerealgenomics/CerealsDB/PDFs/KASP_SNP_Genotyping_Manual.pdf
Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., & Olsen, M. (2013). Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding, 33(1), 1–14. https://doi.org/10.1007/s11032-013-9917-x
Thomson, M. J. (2014). High-Throughput SNP Genotyping to Accelerate Crop Improvement. Plant Breeding and Biotechnology, 2(3), 195–212. https://doi.org/10.9787/pbb.2014.2.3.195

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